小鼠胚胎的冷冻及解冻技术
哺乳动物胚胎的冷冻保存最早成功于 1972 年，Whittingham 等人首次发明了慢速冷刷 ， 对小鼠的胚胎冷冻保存获得成功。解冻后移植产下了后代。他们使用的冷冻保护剂是 DMSO 人工植冰后以 0.33 ℃ /min 的速率降至 -35 ℃，然后再以 1 ℃ /min 的速率降至 -80 ℃后投入液氮中保存。整个过程约需3h。其保存的胚胎 80% 具有继续发育的能力。这种方法经过30年的发展，效果已基本稳定，目前仍然在世界范围内广泛使用。应用这种方法，兔( Whittingham,1976)、鼠(Whittingham,1975) 以及其他共 I6 种动物的胚胎保存成功，解冻移植后产下后代。1977 年，Willadsen 等人对上述方法进行了改良，发明了快速冷冻法，将冷冻降温的时间缩短1h。1985 年Rall 等首次发明了玻璃化冷冻法，对小鼠 8 细胞胚胎冷冻保存取得成功。此后，玻璃化冷冻法经研究者不断改进，日趋成熟。该方法不需要慢速降温过程，胚胎在 0℃ 以上的温度下，置于高浓度且易形成玻璃化的溶液中平衡后，直接投入液氮，使细胞内、外液皆形成玻璃化状态，胚胎不会死亡。
目前,哺乳动物胚胎的冷冻保存技术已广泛应用于生产和科研实践,各种动物的冻胚应用于国际和国内的品种资源的交流和遗传资源的保存。据统计,国际上已有 20 余个国家、近30个单位开展了小鼠冷冻胚胎库的工作。美国杰克逊实验室从 1978 年至今,己冷冻保存 500多个小鼠的品系。
( 一 ) 慢速冷冻法
目前为止沿用的慢速冷冻法,在室温下用 PBS 等生理性溶液配制成 1.O～2.Omol/L的抗冻保护液,将胚胎置于此溶液中处理。采用的抗冻保护剂为 DMSO 、丙三醇和乙二醇等。由于细胞外部的抗冻液渗透压比较高,为保护细胞内、外渗透压的平衡,细胞内的水分向外渗出,胎开始收缩。随后抗冻保护剂渗入,同时水分向细胞内回流,胚胎体积得以恢复。平衡时间需lO～20min。其操作程序如下。
1. 植冰
将胚胎装入配置好抗冻液的 0.25ml 塑料细管中,于程序降温仪中降温。当降温至冰点稍低于冰点温度时(含有 1.5mol/L 抗冻保护液 ,约-4℃)，使用浸入液氮冷却后的镊子夹住细管的棉栓部，瞬间使抗冻液产生冰晶，这种强制性使细胞外液形成冰品的操作称为诱发冰，也称作植冰(ice seeding)。若不实行植冰,在冰点下暂时没有结冰的状态下继续降温，时细胞脱水速度很慢，当细胞外液冰晶形成时,细胞内的水分脱出不完全，使得细胞内部也产生冰晶,导致胚胎死亡。
2. 冷冻
植冰后以 0.3～0.5℃/min的速度降温至-30～-35℃,在降温过程中,细胞外液冰品逐渐增加和溶液不断浓缩,为调节渗透压的平衡,细胞内的水分不断渗出并形成冰晶,使得细胞内、外液的同时浓缩。胚胎与精子相比体积较大,但相对表面积较小,在低温条件下细胞内的水分向外渗出需要一定的时间,所以缓慢降温是非常必要的。如果降温速度过快,水分来不及渗出,在细胞内部便形成冰晶,对细胞产生物理性损伤。最初的胚胎冷冻方法是连续慢速降温到 -6O～-75 ℃时投入液氮中(Whittingtham et al,1972)。随后,冷冻方法得到改进,慢速降温至-25～-35 ℃时投入液氮中冷冻保存(Willadsen,1977)。迄今，上述冷冻方法仍被广泛使用。
缓慢降温使得细胞内液高度浓缩,即使降温到液氮相同的温度,胞质内也不会有冰晶生成。另外，细胞外液的冰品之间也有部分浓缩的溶液存在,这部分溶液也不会形成冰晶。无论是何种溶液，在急速降温的情况下，溶液的黏性急剧增高,形成非结晶的固体的现象，称为玻璃状态，即玻璃化(vitrification)。溶液形成玻璃化的温度(玻璃化转相温度)在-10～-130 ℃之间。若快速通过此温度域,易造成胚胎破裂。所以当样本慢速降温至-25～-35℃(或 -60～-75 ℃)时,不直接投入液氮中，而是在液氮中熏蒸数分钟，使其缓慢通过玻璃化转相温度,然后再投入液氮中，冷冻效果较好。
胚胎在溶液中保存期间，随时间的延长,其生化能力逐渐下降。但是,当细胞外液形成玻璃，即形成固态时，分子停止运动。若要进行长期保存必须在-130 ℃以下,通常使用液氮保存。液氮保存的温度为-196 ℃，液氮气中保存也能保持 -150 ℃。长期冷冻保存的情况下，胚胎解冻后其生存力不会受到影响。
( 二 ) 玻璃化冷冻法
1985 年 Rall 等人利用小鼠的胚胎为实验材料，研发了胚胎玻璃化冷冻法(vitrification)。这种方法不需要程序降温仪进进行慢速降温过程。另外,由于细胞外液不生成冰晶，几乎不产生物理性损伤,操作简单且生存率高。之后,许多研究者对此方法进行不断改良，使其正朝着实 用化方向发展(kasai，1997；加藤等，1997；kasai et aI,1999；Zhu et al,1993)。
玻璃化冷冻法所采用的抗冻保护液，投入液氮中细胞内，外液皆无冰晶生成，即称为玻璃化溶液。此溶液是以PBS为基础液，添加高浓度的抗冻保护剂配制而成。当抗冻保护剂的浓度达到 50%(V/V)，或 8.Omol/L 以上时，选择化学毒性较低的物质是非常必要的。到目前为止，研制出来了多种改良的玻璃化溶液,抗冻保护剂的组合也多种多样。最近大多数研究采用乙二醇为主体抗冻保护剂配制成的玻璃化溶液，浓度约为7.5mol/L(kasai,-1990)。乙二醇且有化学毒性较低、渗透速度较快等特点，对胚胎短时间处理即可达到细胞内外抗冻保护剂平衡，避免其对胚胎的化学毒性作用。
在玻璃化溶液中,添加渗透性抗冻保护剂的同时，有必要添加聚煎糖、葡萄糖聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙二醇、胎牛血清和牛血清白蛋白等高分子物质以及庶糖和海藻糖等非渗透性糖类物质(kasai,1997)。这些物质化学毒性较低,高分子物质对溶液形成玻璃化具有重要作用。添加非渗透性物质也可以降低抗冻保护剂的浓度,因此起到降低玻璃化溶液的毒性作用。另外，荒糖类物质的渗透压作用使细胞发生收缩，从而限制渗透性抗冻保护剂过量地渗入细胞内，间接地起到降低化学毒性的效果。
kasai等(1990) 发明的胚胎一步法玻璃化冷冻保存(如图5-6-1A)。 该方法利用乙二醇为主体抗冻保护剂，添加高分子聚庶糖和渗透压较高的庶糖,配制约 7.5mol/L 浓度的玻璃化溶液，在室温(20℃)条件下，将胚胎直接装人含有玻璃化溶液的塑料细管中，经2min平衡后投入液氮，小鼠桑葚胚冷冻解冻后的发育率达98%，家兔桑葚胚冷冻解冻后 100% 发育到囊胚。
Zhu 等(1993,1994,2000) 研发的二步法玻璃化冷冻 (如图 5-6-lB), 分别采用乙二醇或丙三醇以及乙二醇和 DMSO 为主体抗冻保护剂,配制成 EFS、GFS、EDT 玻璃化溶液，在到(20～25 ℃)条件下，先将胚胎在10%乙二醇 (或丙三醇，或10%乙二醇+10%DMSO) 溶被中预处理 5min，然后再移入含有上述玻璃化溶液的细管中，平衡 30s 后将细管封口 ，投人液集中冷冻保存。小鼠、家兔体内生产的囊胚经冷冻解冻后的继续发育率达 92%～98%。
二步法冷冻处理的优点在于，具有腔体的囊胚，渗透性抗冻保护剂向细胞内渗透需要较长时间，如果在高浓度的玻璃化溶液中直接平衡， 随着时间的延长，化学毒性对胚胎的影响加大。所以首先用低浓度抗冻保护剂预处理胚胎，使抗冻保护剂渗透到细胞内部，然后再移入高浓度玻璃化溶液中平衡，短时间内细胞高度脱水和抗冻保护剂充分渗透后冷冻保存。这种做法既能使抗冻保护剂向细胞内部充分渗透，又能避免高浓度玻璃化溶液的化学毒性的损伤，同时又能很好地形成玻璃化状态， 提高冷冻、解冻后的胚胎存活率。
( 三 ) 解冻方法
慢速冷冻和玻璃化冷冻法的解冻方法有所不同。
1. 慢速冷冻法的解冻方法
慢速冷冻法保存的细管,胚胎由液氮中取出并在空气中停留10～15s 后,浸入室温水制37℃水浴中解冻。空气中停留是为了慢速通过胚胎易产生破裂的温度域 (-110～-130℃。由于此方法受冰晶生成的影响,彻底防止细胞破裂的产生有一定的困难。
慢速降温不论是 -25～-35 ℃或 -60℃以下冷冻保存的样本,其细胞内液的浓缩程度均不充分,在解冻升温过程中有冰晶形成现象,这种现象称为脱玻璃化(devitrification)。脱玻璃化的产生对细胞具有致命性的打击。产生脱玻璃化的温度域为 -80～-50 ℃,升温速度越慢越容易产生此种现象。为避免脱玻璃化现象的产生,解冻时必须快速通过这个温度区域。所以细管在空气中停留后,应迅速浸入水浴中升温。
解冻后将细管中的内容物冲出,用 PBS 或其他等渗液稀释 0.5mol/L 庶糖液脱出细胞内部的抗冻保护剂,然后将胚胎移入等渗生理溶液中洗净备用。
回收的胚胎需在显微镜下操作,胚胎需要重新装入一支细管中移植给受体动物。这种操 作有些繁琐,操作过程中容易丢失胚胎。若像冷冻精液一样，解冻后胚胎不出细管直接移植，则在生产中会更实用。所以有研究者在细管内将冷冻保存液和稀释液用空气层隔开,解冻后用力甩动 ，两液混合后进行移植(Leibo,1983)，近年来这种方法在生产中得到部分应用(Voelkel et al,1992)。上述方法解冻后不经稀释,抗冻保护剂的脱出是在动物子宫中进行。为此应选用对细胞膜通透性强、化学毒性低的抗冻保护为宜。试验证明，乙二醇要比丙三醇等 其他种类的抗冻保护剂效果好。
另外，慢速冷冻法使用的抗冻保护剂的物质的量浓度较低,对胚胎的化学毒性影响较小，所以解冻后的胚胎在细管中放置数十分钟，对其影响不大。
2. 玻璃化冷冻的解冻方法
玻璃化冷冻保存的样本解冻时间时和慢速冷冻法基本相同，细管在空气中停留10～15s后浸入室温(20～25℃)水浴中解冻(如图5-6-2)。 玻璃化冷冻法由于抗冻保护液的物质的量浓度较高,降温和升温过程中，玻璃化转相温度通过的比较缓和，可彻底防止胚胎的破裂现象发生 (kasai et al,1996)。
玻璃化溶液中含有高浓度抗冻保护剂，在液氮中处于超低温状态的情况下，若抗冻保护剂的浓度达不到所要求的程度，在浸入水浴中解冻数秒后可观察到有乳白色(脱玻璃化)现象产生。脱玻璃化使细胞内产生冰晶,直接影响胚胎的存活。为此，在易产生脱玻璃化的温度域(-80～-50℃）应快速升温，对防止脱玻璃化现象的产生非常重要。
玻璃化溶液中抗冻保护剂的含量较高，对细胞的化学毒性影响也较大。解冻后若不经稀释，在室温下放置,短时间内胚胎就会死亡。所以解冻后应尽快将细管中的内容物冲出，并在 0.3～1.0mol/L 蔗糖溶液中稀释以脱出细胞内部抗冻保护剂。借助蔗糖溶液的渗透作用，使细胞进一步脱水而收缩,在脱水的同时将细胞内部的抗冻保存剂一同脱出。然后再在等渗的生理溶液(PBS液等)中洗净后供胚胎移植或其他实验使用。
（四）冷冻与解冻操作方法
1、慢速冷冻与解冻方法操作 (2-8 细胞期胚 )
(1) 胚胎采集 按本章第二节所述的方法采集小鼠 2～8 细胞期胚胎，用 HEPES-HTF液洗涤数次，移入盛有含 10% 血清替代品(SSS)(Irvine Scientific)HIF液的四孔培养皿中，加盖矿物油(Sigma USA)，于 37℃, 5% C02培养箱中培养。
(2) 胚胎冷冻过程 采用丙二醇结合蔗糖作为冷冻保护剂对胚胎进行冷冻保存。采用慢速冷冻的方法进行胚胎冷冻。将胚胎放入磷酸盐缓冲液 (PBS) 冲洗数次； 移入含1.5mol 丙二醇的 PBS 液，平衡 l0min，转入含1.5mol 丙二醇、0.1mol 庶糖 PBS 液，并将胚胎装入冷冻管中，每一冷冻管中装 20~30 个胚胎，放入程序冷冻仪中进行冷冻。从室温( 25 ℃左右 ) 以- 1℃/min 降温到 -6 ℃；浸润 1min，植冰，再保温 9min；以-0.3 ℃/min 降温到 -32 ℃； -0.2 ℃/min 降温到 -36 ℃； -1℃/min 到 -75 ℃；将冷冻管直接放入液氮中冷冻保存。
(3) 解冻 解冻时,冷冻管在室温下停留40s，然后放入 30℃ 水浴 40s。随后，胚胎放入冻液(1.0mol 丙二醇，0.2mol 蔗糖 PBS 液) 5min，胚胎用预先在 37℃，5% CO2 平衡好的 HTF 洗涤数次。胚胎的冷冻和解冻试剂均含有 20% FBS。在倒置显微镜下观察冷冻胚胎的活率。
2、 玻璃化冷冻与解冻操作方法 ( 囊胚或晚期桑葚胚 )
(1) 胚胎采集 按本章第二节所述的方法采集小鼠早期囊胚或晚期桑葚胚，再用 DPBS 被清洗3次后备用。
(2) 液体的配制
DPBS 液： DPBS 粉剂加定量双蒸水。
平衡液 EG10： 乙二醇与 DPBS 液按体积比 1:9 混合。
冷冻液 EFS40 ( 玻璃化冷冻液 )： 30% 的聚蔗糖 +0.5mol 蔗糖经DPBS 液溶解后与乙二醇按体积比 6:4 混合。
解冻液 : 用 DPBS 液配制的 0.5mol/L 蔗糖液。
以上所有液体配制后均经 0.20µm 醋酸纤维素膜无菌过滤。
培养液 M16。
(3) 冷冻程序 用 DPBS 液清洗 3 次小鼠胚胎后移人 EG10 乎衡液微滴中,每个 50µl 的微滴中移入20枚左右的胚胎。平衡 10min 后,将胚胎吸出,移人事先装有150µl 冷冻液的细胞冷冻管中。盖紧盖后将细胞冷冻管放置 -20℃冷冻室中10min, 然后置液氮面上 5min, 最后投入液氮中冷冻。
(4) 解冻 将细胞冷冻管从液氮中取出,放入 25 ℃ 的水浴中, 30s 后拧开管盖,加入 400µl 解冻液,摇匀后倒入培养皿中，然后再向细胞管中加入 200µl 解冻液,轻摇后倒入培养皿中,迅速将胚胎吸出，移入新鲜的解冻液中，5min 后拣出胚胎在 DPBS 液中清洗 6～8 遍,待用。
附件：胚胎冷冻试验示例
胚胎供体 4.5 周龄清洁级 ICR小鼠、 Lats杂合子峻性小鼠， 3月龄清洁级ICR小鼠、Lats雄性杂合之小鼠;假孕鼠8周龄清洁级ICR小鼠。
1. 2 主要仪器设备试剂
二氧化碳培养箱，贺利氏公司生产，PCR 仪。 Biometra 公司生产; 400 系列体视显微镜, Motic公司生产; 显微剪、显微镊，上海手术器械厂生产；吸卵针自制。 DPBS粉剂、透明质酸酶，上海Sangon公司生产: PMSG (天津实验动物中心生产，批号： 951226)； hCG (上海生物化学制药厂生产，批号：9805091), LDS-30液氮罐〈成都液氮容器厂)，0.25ml 冷冻麦管；1.5 ml 细胞冷冻管。蛋白酶 K、透明质酸酶、 PCR引物、 Taq 酶及 PCR所需的其它试剂均由上海Sangon 公司生产。
1. 3 胚胎获得
供体小鼠超排处理：每只注射 5IU 的 PMSG、间隔 48h后再注射 hCG。注射 hCG后与成年 ICR 或 Lats杂合子雄性鼠进行交配，见栓鼠于 hCG 注射 80h后颈椎脱臼处死，取出子宫，用 DPBS液冲洗并收集冲洗液于集卵皿中。在体视显微镜下收集早期囊胚和晚期桑椹胚，再用 DPBS液清洗几次后备用。
1.4. 液体的配制
1.4.1 DPDS液： DPBS粉剂（购于 Sangon公司〉加定量双蒸水。
1.4.2 平衡液 EG10： 乙二醇与 DPBS液按体积比 1：9 混合。
1.4.3 冷冻液 EG40： 乙二醇与 DPBS液按体积比 4：6 混合。
1.4.4 冷冻液 ES40： 蔗糖溶于 DPBS液中.然后与乙二醇混合，使蔗糖终浓度为 0.25M；乙二醇浓度为 40% (V/V)。
l 4.5 冷冻液 EFS40 (玻璃化冷冻液)： 30% 的聚蔗糖 +0.5 M 蔗糖经 DPBS 液溶解后与乙二醇按体积比 6：4 混合。
1.4.6 解冻液： 用DPBS 液配制的 0.5M 蔗糖液。以上所有液体配制成后均经0. 22 um 醋酸纤维素膜无菌过滤。
1.4.7 培养液：MI6 (购于 Sigma公司）
1. 5 胚胎冷冻程作
1.5.1 冷冻麦管一步法：用带有 16 号针头的 0.5ml 的 注射器从冷冻麦管有棉塞的一头，先吸入一段 6cm 的解冻液；接着吸一段 0.5cm 的空气后， 吸入
1 cm 的冷冻液，以清洗管壁上粘附的解冻液；然后再吸入0 .5cm 的空气，接着再吸入 lcm 的冷冻液，用吸卵针将胚胎从 DPBS液中吸出，快速的在冷冻液中消洗-次，然后将胚胎吹入 1cm 的冷冻液中，静置 1.5-4min，在静置的同时，再吸入 0.5cm 的空气，最后一次吸入 1cm 的冷冻液后热封口。快速将封口的冷冻管投入液氮中，先使冷冻管的一半浸入液氮中，片刻后全部浸入。使胚胎在最短的时间内冷冻。
1. 5 .2 冷冻麦管二步法：装管方法同一步法，但装管前胚胎预先在平衡液中平衡 5-l0 min，胚胎吹入冷冻液后迅遮封口，投入液氮，不需静置。
1 .5 .3 细胞冷冻管二步法：细胞冷冻管中移入 l50ul 的冷冻液，然后将平衡 5-10 min 后的胚胎吹入，益紧盖后，将细胞冷冻管置于液氮面上 l分钟后，投入液氮。
1. 5 .4 细胞冷冻管一步法：细胞冷冻管中移进 l50ul 的冷冻液，将胚胎从 DPBS 液中吸出，吹入冷冻液中，盖紧盖后静置 1.5min，将细胞冷冻管置于液氮面上 1min后，投入液氮。
1. 6 胚胎解冻
1.6.1 冷冻麦管法解冻：将麦管从液氮中取出，在空气中停留 10s 后，放入 25℃ 的 水浴中 5s 左右，当冷冻管中冷冻液变成透明时，取出冷冻管，试净水后，剪掉冷冻管两端，用 400ul左右的解冻液从原棉塞端将胚胎冲至预先放有 200u1解冻浓的培养皿中，摇均后，迅速将胚肪吸出，移入新鲜的解冻液中，5min后，拣出胚胎，在DPBS液中清洗 6-8 遍，待用。
1.6.2 细胞冷冻管法解冻：将细胞冷冻管从液氮中取出，放入 25℃ 的水浴中， 30s 后，拧开管盏，加入 400u1 解冻液，摇匀均后倒入培养皿中，然后再向细胞管中加入 200ul 解冻液，轻摇后倒入培养皿中，迅速将胚胎吸出，移入新鲜的解冻液中， 5min 后，拣出胚胎，在 DPBS 液中清洗 6-8 遍，待用。
1.7 胚胎体外培养
解冻后在 DPBS 液中请洗过的胚胎在 M16 中清洗数次后，置于上面覆石蜡油的 MI6 培养液中，在 5% CO2、 37 ℃下进行微滴培养 （微滴为 100ul 左右，每滴中胚胎数为 10 枚左右，培养之前，培养液、石蜡油、培养皿放置 CO2箱中平衡 2h)，观察发育数 ( 48h恢复或发育至囊胚数) 和孵化数（发育至脱去透明带)。
1.8 胚胎移植
1.8.1 移植体： 体内7-10小时的受精卵到体内或体外培养的4-5天的囊胚都可以移植到受体小鼠（继母小鼠）。
1.8.2 受体小鼠的选择与交配：
6-10 周龄的雌性小鼠均可作为胚胎移植的受体使用。与其它品系的小鼠比较，昆明鼠体形较大，适应及抗病性强，母性好，是良好的胚胎移植受休。可供胚胎植入的受体小鼠有两种：即假孕寄母小鼠和自然怀孕的受体小鼠，这可根据所移入的胚胎数量来决定选择。小鼠一般为半夜交配和排卵，所以第2天有阴栓者从上午到下午为见栓的 0.5-1 天，这种雌鼠可用于输卵管移植。也可使用见阴栓 2.5 和 3.5 天的假孕或自然怀孕的小鼠做受体，但只能从子宫部位移植，且移植的胚胎须达到桑椹胚和囊胚生长阶段。若待移植胚胎数较少如仅为1-4 枚时，则应用自然怀孕的雌性鼠做受体。
1） 假孕鼠： 将发情的 ICR母鼠与结孔 ICR公鼠 1：1合笼交配，第二天:早晨检查阴道栓，见栓者为假孕第一天。
2）子宫移植: 选择假孕第 3.5d的小鼠为受体，进行子宫角移植。每侧移植 6-10枚解冻后经 DPBS液清洗过的胚胎， 7天后解剖观察着床胚胎数。
1.8.3 麻醉： 可用1.5% 的戊巴比妥钠（0.15-0.2mg/10 g 体重）腹腔注射麻醉，效果很好; 也可采周氯氨酮 ( 0.6-1.2mg/ l0 g 体重) 或氨基甲酸乙酯 ( 1.2 -1.6 mg/ 10 g体重) 做麻醉剂。注射后一般 5-10 分钟即可起效。维持时间在 0.5-1 小时之内较好。少数小鼠使用上述剂量不能有效麻醉，可略为补充。麻醉较好的标准是小鼠安静不抑扎，稍微用力掐后肢时小鼠会抽回。
1.8.4 移植操作:
输卵管移植输卵管移植的方式又旬两种，现分别介绍。
1） 经喇叭口移植法：麻醉小鼠，除去手术区背毛，背中略靠后纵向切(剪）开一长为 10-15mm 的纵向开口，通过透明的背肌体壁确定卵巢、输卵管和子宫的位置，并在其上方的体壁上开一小口。用眼科镊子轻轻拉出卵巢、输卵管及部分子宫。避开血管，征包裹卵巢和输卵管开口的卵巢囊膜上撕开一小口，用尖镊子固定住输卵管开口或漏斗部，然后把直径为 100 -120 um 的玻璃胚胎细管从输卵管开口即漏斗部插入，将胚胎及少量培养液吹入输卵管，若遇到卵巢囊内充血或卵巢囊膜出血，可用消毒的卫生纸或滤纸及时吸去血液。
2) 经膨大部移植法: 手术方式及顺序同经喇叭口移植法。拉山卵巢和l输卵管后，先用 4号针尖 (或更细一些的胰岛素注射针头) 在输卵管膨大部前上方靠近卵巢的部位扎一小口，注意避开血管。针尖可预先沾点 1% 的台盼蓝以指示输卵管上的开口位置。然后将装有胚胎的玻璃管轻轻插入小口，并推进到输卵管膨大部，将胚胎吹出。这可以胚胎移植管巾胚胎前后的气泡都进入输卵管作为杯志。与经喇叭口移植法相比较，经膨大部移植法不受卵巢囊内充血的影响，且在移植时应尽量选用细的胚胎移植管径。
3） 子宫内移值：子宫内移植的手术难度较小，但只适用于从桑椹胚到胚囊期阶段的胚胎。方法是选见阴栓第 2.5 天或第 3.5 天的怀孕或假孕雌鼠。背位开一口，在子宫角靠输卵管部位选血管分布少的部位，用 4 号针扎一小孔，然后用玻璃微管把桑椹胚或囊胚期的胚胎移入。
无论何部位的移植，都应尽量避免带入多余的培养液或气泡。每次移入操作后，也将移植管尖端浸入培养液中，在解剖镜下检查移植管中有无余留胚胎。若有，应再次补移。为确足移入胚胎的分布，可在移入后的第 10 天或 18.5 天打开腹腔检查移植胚胎的植入或分布以及胎儿成活情况。 18.5 天的胎儿从子宫中取出后可用同期产子的继母小鼠哺育。胚胎移植的受体小鼠应编号。
1.9 Lats基因检测
DNA提取：出生后小鼠十五天左右剪尾， 0.5 cm左右， 置于 l.5ml 的 Eppendoff 管中，加入 500 ul 的消化液（50mM Tris-HCI PH8.0, 100mM EDTA，5% SDS )，20ul 蛋白酶 K 溶液，置于55 C摇床中消化过夜。消化停止后，每管中加入酚-氯仿混合物 (1：1) 500μ1，摇晃 5 min后，13000rpm离心5min。小心吸取上清 500ul 移入新的 Eppendoff 中，加入两倍的无水乙醇，可见有絮状物出现。室温下 10-12000 rpm 离心 5min，弃去液体，加入 70% 的乙醇洗两次，待管内液体全部挥发以后加入 l00ul TE（10mM Tris PH8.0, 0.l mM EDTA)。37 C水浴 2h，使 DNA充分溶解。
参照 Lats基因的序列，以及敲入抗新霉素基因(neo)序列，设计两对引物如下：
P1 M41g 5' -GTACACGCCTAAGGGATTCATCTA-3'
P2 M41rv 5'-ATCCTAGCAGAAGCCGACAATGAG-3'
P3 neo3 5'-GCCAATATGGGATCGGOCCATTGA-3'
P4 neo4 5'-CCTCAGAAGAACTCGTAAGAAGG-3'
结论：EG40、ES40冷冻液二步法的冷冻结果最好，解冻后囊胚发育率达到50-80%。以EFS40为冷冻液的Lats小鼠玻璃化冷冻液冷冻后，囊胚发育率达90-95%，着床率50-60%。ES40、EFS40冷冻液的快速冷冻法和玻璃化冷冻法比EG40好。尤其是用细胞冷冻管进行玻璃化冷冻，简单实用，冷冻效果理想。
