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蛋白质免疫印迹（Western blot）中常见问题与解决方法
免疫印迹，通常也叫Western Blot，是一种蛋白研究的基本技术，虽然每个实验室都有自己的方法，但基本的步骤大致相同，然而有个别老师做完实验得不到满意的实验结果，会来和小爱抱怨抗体问题，其实很多问题可能是一些实验的小细节在搞破坏，这里小爱为大家罗列了一些常见的WB实验的“破坏”分子，希望老师们都可以做出满意的结果！
1、转膜不充分
可能的原因 |
验证或解决方法 |
膜没有完全均匀湿透 |
使用100%甲醇浸透膜 |
靶蛋白分子量小于10kDa |
选择小孔径的膜，缩短转移时间 |
靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液PH值 |
可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（PH10.5）或使用低PH值缓冲液如乙酸缓冲液 |
甲醇浓度过高 |
过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移，降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 |
转移时间不够 |
对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间 |
2、背景高
可能的原因 |
验证或解决方法 |
膜没有完全均匀湿透 |
使用100%甲醇浸透膜 |
洗膜不充分 |
增加洗液次数和洗液体积 |
封闭不充分 |
增加封闭液孵育时间，或者提高温度，选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BS，,酪蛋白等） |
二抗浓度过高 |
降低二抗浓度 |
检测过程中膜干燥 |
保证充分的反应液，避免出现干膜现象 |
曝光过度 |
缩短曝光时间 |
抗体与封闭蛋白有交叉反应 |
检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂，洗涤剂中加入Tween-20可减少交叉反应 |
二抗的非特异性背景 |
增加一个二抗对照：不加一抗，其它条件不变，即可验证背景是否有二抗系统来源。选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链） |
3、无信号
可能的原因 |
验证或解决方法 |
抗体染色不充分 |
增加抗体浓度，延长孵育时间 |
酶失活 |
直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明失活，选择在有效期内有活性的酶联物 |
标本中不含靶蛋白或靶蛋白蛋白太低 |
设置阳性对照，如果阳性对照， |
试剂之间不匹配 |
一抗与标本种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配，通过设置内参可以验证二级检测系统的有效性 |
一抗失效 |
选择有效期内抗体，并选择现配现用的工作液 |
HRP抑制剂 |
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 |
4、弱信号
可能的原因 |
验证或解决方法 |
抗体染色不充分 |
增加抗体浓度，延长孵育时间 |
酶活性降低 |
直接将酶和底物进行混合，如果显色弱则说明酶活性降低了。选择在有效期内，有活性的酶联物 |
标本中靶蛋白含量太低 |
增加标本上样量 |
洗膜过度 |
缩短洗涤时间和次数 |
抗体活性降低 |
选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置 |
封闭过度 |
较少封闭剂的量或缩短时间；更换不同封闭类型 |
曝光时间过短 |
延长曝光时间 |
HRP抑制剂 |
所用溶液和容器中避免含有叠氮钠 |
5、非特异性条带（多条带）
可能的原因 |
验证或解决方法 |
二抗的非特异性结合 |
增加一个二抗对照（不加一抗，其它操作不变）即可验证背景是否由二抗系统来源；选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链） |
蛋白降解 |
使用新鲜制备的抗体，并使用蛋白酶抑制剂 |
抗体浓度过高 |
降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带 |
不同剪切体的存在 |
有些来源于同一基因的蛋白有不同的剪切方法，每个剪切方式得到的蛋白大小都是不同的 |
细胞传代过多导致蛋白变异 |
使用原代或传代的细胞作对照 |
蛋白上样量过大 |
降低上样量 |
6、条带大小不对
可能的原因 |
验证或解决方法 |
二聚体或多聚体存在 |
增加蛋白质变性过程及强度 |
翻译后剪切 |
比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能是需要进行剪切成活化的形式，如procaspases |
蛋白修饰 |
比如氨基化、磷酸化等修饰状态回导致蛋白分子量增加 |
7、背景有黑色斑点
可能的原因 |
验证或解决方法 |
封闭试剂中有聚集体 |
使用前过滤封闭试剂 |
孵育液中有聚集体 |
使用前过滤孵育液 |
抗体和封闭试剂反应 |
使用前过来吧封闭试剂 |
HRP偶联二抗中有聚集体 |
过滤二抗试剂 |
8、背景有不均匀的白色斑点
可能的原因 |
验证或解决方法 |
转膜过程中有气泡产生 |
仔细检查，避免存在气泡 |
抗体分布不均匀 |
孵育抗体时使用摇床 |
9、微小条带
可能的原因 |
验证或解决方法 |
电泳速度过快 |
减少电压减慢电泳速度 |
电泳速度过高 |
在冷室或冰浴中进行电泳，改变电泳PH值 |
10、膜出现反像（白色带）
可能的原因 |
验证或解决方法 |
HRP含量过高 |
降低酶联二抗浓度 |
11、Marker变黑色
可能的原因 |
验证或解决方法 |
抗体和marker蛋白反应 |
在marker和sample之前空出一个孔不上样 |
爱必信经典产品，其中有两款经典的WB产品
货号 |
品名 |
规格 |
促销价 |
abs50001 |
Annexin V-FITC apoptosis assay kit |
50T/100t |
630/1102.80 |
abs920 |
ECL化学发光检测试剂盒 |
2*250ml |
693 |
abs922 |
预染蛋白marker, 10-180kDa |
500ul |
492 |
abs924 |
预染蛋白marker, 10-180kDa |
2×250ul |
372 |
abs923 |
预染蛋白marker |
500ul/5*500ul |
600/2400 |
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