Transwell 迁移/侵袭实验
1、基本原理
将 Transwell 小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。侵袭实验中使用到的 Matrigel 是从小鼠 EHS 肉瘤中提取的基质成分，含有 LN、IV 型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在 DMEM 培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。
Transwell 小室的滤膜孔径一般为8μm，在侵袭实验中，膜孔都被 Matrigel 覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有 Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。
2、所需材料
· Transwell 小室 （8-10μm 孔径，Coster 或 Corning）； 24 孔培养板；BD 公司的 Matrigel（5 mg/ml, -20C， 1:5 或 1:8 稀释）
· 胎牛血清
· 细胞生长培养基：无血清 DMEM；1% FBS DMEM；10% FBS DMEM；1640 培养基、1640 完全培养基
· 胰蛋白酶
· PBS
· 青霉素-链霉素溶液（100×）
· 结晶紫或台盼蓝
· 甲醇
· Matrigel（侵袭实验）
3、主要试剂配置
（1）PBS 磷酸盐缓冲液： PBS 粉剂每袋加 ddH2O 定容至1000 ml，调pH7.2，121℃，30 min，高压灭菌，4℃保存。
（2）细胞生长培养基：-20℃ 保存，临用前按体积比配成含10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素双抗的完全培养液。
4、操作步骤
1．所有细胞培养试剂和细胞培养池放在37℃温育；
2．待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用 PBS 和无血清培养基先后洗涤 1 次，用无血清培养基（或含 0.05-0.2% BSA 的无血清培养基）悬浮细胞，计数，调整细胞浓度为2-5×10^5 /ml；另外，也可在制备细胞悬液前无血清饥饿细胞 12-24 h。
3．如进行侵袭实验，将 Matrigel 胶从 -20℃ 取出于4℃ 冰箱过夜，在4℃ 条件下（预冷枪头和离心管，最好在冰浴上操作）将 Matrigel 胶用无血清的细胞培养基稀释至300 μl/ml（或对 5 mg/ml 的原 Matrigel 以1:5稀释成 1mg/ml），取100 μl 均匀涂抹一层于细胞培养池的PET膜上表面，然后将培养池轻轻放入 24 孔板孔内，37℃ 放置 3-5 h 左右，取出于超净工作台过夜干燥。使用前进行基底膜水化。
注：如进行迁移实验，则跳过这一步骤
4．在下室（即 24 孔板底部）加入600－800 μl 含10％（或20%）血清的培养基，上室加入 100－150 μl 细胞悬液，注意在下室培养基与小室之间不能有气泡，如有气泡，要将小室提起，去除气泡再轻轻放回，继续在孵箱培养 24 -48 h；对于迁移能力弱的细胞，可将下室培养基用 3T3细胞培养过夜，取上清再加 50g/ml 的 FN（Fibronectin）做为下室培养基。
5．取出小室，弃去孔中培养液，用无钙的 PBS 洗 2 遍，将其下表面浸泡在70%甲醇（或 4% 的多聚甲醛，或 5% 戊二醛）溶液中，固定 30 min~60 min，然后取出适当风干，用结晶紫（Crystal violet, 0.1% working solution in PBS）或台盼蓝 (Trypan blue, 0.4% working solution, 4% stock solution, PBS) 或 Giemsa 染色 20 min， 用湿棉签轻轻擦去上层未迁移细胞，用无钙 PBS 洗 3 遍，400 倍显微镜下镜检，并计算PET膜下表面的细胞数，计算中间和四周 5 个视野，取平均值。
另外，可用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树脂封片；显微镜下去 9 个视野计数和统计。
5、实验结果
镜下对染色后的细胞进行计数，计数值高，则该组细胞迁移/侵袭能力强。
