生物素-链霉亲和素结合系统及应用
生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244．31Da．生物素分子有两个环状结构（如图1），其中Ⅰ环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环，C2上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构，经化学修饰后，生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素。活化生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质，核酸，多糖，脂类等。由于它对链霉亲和素的异常强的结合亲和力通常被用来检测和监测目标生物学靶标。生物素具有两个特性，使其非常适合于生物缀合物的开发。 首先，生物素的体积相对较小。这允许将多个生物素标签标记为单个蛋白质或抗体，而不会显着阻碍其生物反应性。其次，是生物素分子的戊酸侧链。该链可被衍生化，以促进用于化学标记生物素的各种反应基团结合到蛋白质上，而不会改变生物素对链霉亲和素的结合亲和力。
亲和素（avidin，AV）亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kD，等电点pI=10.5；耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用．尤其是与生物素结合后，稳定性更好。生物素与亲和素间的作用是已知强度最高的非共价作用，亲和常数（K）为1015mol/L，比抗原与抗体间的亲和力（K=105～1011mol/L）至少高1万倍。并且，二者的结合稳定性好专一性强，不受试剂浓度，PH环境，抑或蛋白变性剂等有机溶剂影响。由于每个亲和素能结合4个分子的生物素，这一特点可以用于构建一个多层次信号放大系统。因此，BAS即可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。亲和素由于带有一个糖链侧链，导致容易和细胞表面的多糖发生非特异性亲和。因此，链霉亲和素被开发出来。
链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素，并且不带任何糖基，因此与亲和素一样，一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数（K）亦为1015mol/L。链霉亲和素是一种稍偏酸性（pH6.0）的蛋白质，其氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基；链霉亲和素的适用范围比亲和素更为广泛。在蛋白水解酶作用下，链霉亲和素可在N端10～12和C端19-21间断裂，形成的核心链霉亲和素仍然保持完整的结合生物素的能力。链霉亲和素的活性单位也是以结合1μg生物素所需的量来表示，1mg链霉亲和素的最高活性可达18U。
生物素-链霉亲和素结合系统的广泛采用主要是由于两个因素。第一个是生物素和链霉亲和素分子本身相对较小，它可以与生物活性大分子（例如抗体）广泛结合，而不会对其功能（即抗体的结合位点）产生抗性。第二个是生物素和链霉亲和素彼此结合的特异性，以及后续键的强度，可实现强大的流线型生物测定应用。链霉亲和素四聚体对生物素具有极高的结合亲和力，解离常数（K d）约为10 -14摩尔/升。这种紧密而特异性的结合是快速的，并且能够承受pH，温度，有机溶剂和变性剂的极端作用。
图1.链霉亲和素-生物素相互作用的图示。链霉亲和素的多价特性使其能够以高度亲和力结合多达四个生物素分子。生物素通常与酶，抗体或靶蛋白缀合。
- 生物素-链霉素标记的应用
1、生物素与诊断
BAS-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。
BAS用于检测的基本方法可分为三大类。
第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。
LAB
BRAB
第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为桥联亲和素-生物素法(BRAB)。 [1]
ABC
第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。这一方法可以将微量抗原的信号放大成千上万倍，以便于检测。
2、生物素与亲和层析
亲和层析是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。
生物素-亲和素系统可以与亲和层析的方法结合，大大提高纯化蛋白质的纯度，或者为已知配体寻找受体。步骤是首先将生物素共价结合到配体蛋白上，再将生物素化后的配体蛋白加入含有受体蛋白的混合物，然后将此混合物通过预先固定了亲和素的层析柱，这时配体受体复合物就通过生物素-亲和素系统停留在层析柱上，最后通过选择性洗脱获得此受体配体蛋白复合物或者仅有受体。这一方法被广泛运用于药物研发行业，当人们发现某种药物分子具有疗效但是又不清楚它具体作用于哪种蛋白质时，可以将其生物素化然后把靶蛋白从成千上万种蛋白质中“抓”出来。
生物素-亲和素系统还可以用相似的方法分离DNA.方法是在DNA探针的一端挂上生物素，然后用其获得目的DNA片段，再利用固定化的亲和素回收这些DNA。
3、生物素与链霉亲和素磁珠分子分离
使用纳米表面生物技术将重组中性链霉亲和素共价偶联到超顺磁性磁珠微球表面，形成单分子固定层，可用于生物素化核酸、生物素化抗体或其他生物素化配体和靶分子的分离和检测。由于具有单层的链霉亲和素，其表面的绝大多数生物素结合位点在空间上不仅可以结合游离生物素，而且还可以结合生物素化的配体/靶标，使用简单有效。本制品独特的特异性表面便于进行高效捕获、分离和下游操作，可保证批次一致性和结果的可重复性。本制品是以聚合物为基材的实心磁珠微球，主要用于免疫检测、免疫沉淀、分离核酸、细胞分选等。
4、生物素与定位观察
亲和细胞化学是利用两种物质之间的高度亲和能力而相互结合的化学反应， 广义上说，抗原抗体相互作用也是一种物质间的相互亲和。先令生物素衍生物（如结合了生物素的凝集素）与细胞表面的糖链结合，然后再用被亲和素标记的探针定位，这种方法更有利于微量抗原(或抗体)在细胞或亚细胞水平的定位。此外，在转染（blot technology）蛋白质，糖蛋白或者DNA过程中，使用生物素-亲和素系统介导染色比传统直接染色方法具有更高的灵敏度。
5、生物素与基因探针
传统的基因探针是由带放射性的磷酸碱基合成的，我们可以用被生物素标记的磷酸碱基合成基因探针，避免了实验过程中放射性物质可能造成的伤害。
生物素与基因探针
二、生物素-链霉亲和素系统的优点
生物素-链霉亲和素系统的主要优势在于其提高检测灵敏度的能力。这在很大程度上是由于链霉亲和素的四聚体构象。一种链霉亲和素蛋白具有以高亲和力和选择性结合四个生物素分子的能力。这种多样性使得能够放大微弱的信号，并以简单的工作流程提高了对哺乳动物细胞或组织中中等和低丰度靶标的检测灵敏度。
另一个关键优势是生物素-链霉亲和素系统的多功能性。由于链霉亲和素可以与多种报道分子标记物偶联，因此几乎可以将其掺入每个免疫测定中。例如，链霉亲和素的酶结合物被用于酶联免疫吸附测定（ELISA）中，而荧光标记的链霉亲和素，例如iFluor™488链霉亲和素，被广泛用于细胞表面标记，荧光激活细胞分选（FACS）和其他荧光成像应用。
三、 现有应用领域
酶联免疫吸附测定（ELISA）
免疫组织化学（IHC）
Power Styramide™信号放大，可替代酪胺
免疫印迹
免疫荧光显微镜
细胞表面标记
亲和纯化
荧光激活细胞分选（FACS）
流式细胞仪
特色产品
荧光生物素衍生物
生物素化二抗
生物素化核苷酸
生物素化氨基酸
活性生物素衍生物
ReadiLink™蛋白质生物素化试剂盒
Amplite™比色生物素定量试剂盒
1. 荧光生物素衍生物
荧光生物素衍生物在同一分子中同时包含荧光团和生物素部分。这些试剂用于通过荧光检测和定量生物素结合蛋白。与链霉亲和素与荧光生物素结合相关的强烈淬灭可用于精确测量链霉亲和素（或抗生物素蛋白）的浓度。
表1.荧光生物素衍生物
产品名称 |
Ex/Em (nm) |
Ext. Coeff.¹ |
FQY² |
规格 |
货号 |
Biotin-4-fluorescein *CAS 1032732-74-3* |
492/518 |
80,000 |
0.7900 |
5 mg |
3006 |
Fluorescein biotin |
497/516 |
80,000 |
0.7900 |
5 mg |
3017 |
Cy5 biotin conjugate |
650/669 |
250,000 |
0.27 |
5 mg |
3100 |
注意：
Ext. Coeff. = 在其最大吸收波长处的摩尔消光系数（单位= cm -1 M -1）。
FQY = 在水性缓冲液（pH 7.2）中的荧光量子产率。
2.生物素化二抗
我们提供生物素化的二抗，可与基于链霉亲和素的扩增技术一起使用。使用生物素化的二抗的主要优势在于，只需简单地使用不同的链霉亲和素偶联物，即可在各种应用中灵活使用相同的生物素化二抗。
图2 HeLa细胞中α-微管蛋白的免疫荧光染色
表2.生物素化二级抗体的可用产品
产品名称 |
宿主/亚型 |
物种反应性 |
规格 |
货号 |
生物素化山羊抗小鼠IgG（H + L） |
山羊/ IgG |
老鼠 |
1 mg |
16729 |
生物素化山羊抗兔IgG（H + L） |
山羊/ IgG |
兔子 |
1 mg |
16794
|
3. 生物素化核苷酸
可以将生物素修饰的三磷酸核苷类似物（例如dUTP和dCTP）通过酶法掺入DNA或RNA片段中，以用于荧光原位杂交（FISH），DNA阵列，微阵列和其他杂交技术。标准的酶促非放射性DNA标记反应包括3'-末端标记，cDNA标记，Nick翻译，PCR和随机引物标记。每个生物素化的核苷酸在生物素及其在核苷酸上的连接点之间包含11、14、16或20原子的间隔区间。这有助于通过荧光团和酶标记的链霉亲和素结合物或琼脂糖磁珠进行检测和信号放大。
表3. 生物素化核苷酸
产品名称 |
连接物长度 |
规格 |
货号 |
生物素-11-dUTP |
11个碳 |
25 nmoles |
17016 |
生物素16-dUTP |
16个碳 |
25 nmoles |
17017 |
生物素20-dUTP |
20个碳 |
25 nmoles |
17018 |
生物素-14-dCTP |
14个碳 |
25 nmoles |
17019 |
4. 生物素化氨基酸
生物素化的肽适用于需要固定在链霉亲和素或抗生物素蛋白包被的微量滴定板，珠子或膜上的免疫检测研究和生物医学筛选分析。在Fmoc固相合成过程中，生物素可与肽段的N末端或赖氨酸（Lys），谷氨酸（Glu）或天冬氨酸（Asp）的侧链相连。FMOC-Glu（生物素-PEG）-OH和FMOC-Asp（生物素-PEG）-OH中的PEG-间隔物的比例降低，可降低目标肽和链霉亲和素之间的空间位阻，从而获得更好的生物素结合。PEG-间隔基的亲水性质使非特异性作用最小化，并提高了试剂和生物素化肽的溶解度。
表4. 生物素化氨基酸
产品名称 |
标签原理 |
衍生物 |
规格 |
货号 |
FMOC-赖氨酸（生物素）-OH |
使用FMOC-SPPS制备生物素标记的肽 |
赖氨酸 |
100 mg |
5020 |
FMOC-Glu（生物素-PEG）-OH |
使用FMOC-SPPS制备生物素标记的肽 |
谷氨酸 |
100 mg |
5026 |
FMOC-Glu（生物素-PEG）-OH |
使用FMOC-SPPS制备生物素标记的肽 |
谷氨酸 |
1 g |
5027 |
FMOC-Asp（生物素-PEG）-OH |
使用FMOC-SPPS制备生物素标记的肽 |
天冬氨酸 |
100 mg |
5023 |
FMOC-Asp（生物素-PEG）-OH |
使用FMOC-SPPS制备生物素标记的肽 |
天冬氨酸 |
1 g |
5024 |
5. 反应性生物素衍生物
反应性生物素衍生物包含反应性基团，例如琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺，它们有助于将生物素标记到蛋白质，抗体和其他大分子上。选择反应性生物素衍生物时，请注意以下事项：
官能团靶向 -特定的反应性部分靶向并结合到它们各自的官能团上，以进行蛋白质和其他大分子的靶向或非选择性生物素化（例如琥珀酰亚胺酯靶向伯胺，马来酰亚胺靶向巯基或巯基）。
溶解度 -这会影响目标蛋白质或大分子的生物素化。
间隔臂长度（PEG） -提高目标蛋白的检测灵敏度并减少空间位阻
表5. 反应性生物素化试剂
产品名称 |
靶向官能团 |
反应基团 |
规格 |
货号 |
生物素X琥珀酰亚胺酯*
CAS 72040-63-2 * |
胺 |
琥珀酰亚胺酯 |
25 mg |
3010 |
生物素琥珀酰亚胺酯* CAS 35013-72-0 * |
胺 |
琥珀酰亚胺酯 |
100 mg |
3002 |
生物素PEG4琥珀酰亚胺酯 |
胺 |
琥珀酰亚胺酯 |
25 mg |
3022 |
生物素-PEG3-叠氮化物* CAS 945633-30-7 * |
炔烃 |
叠氮化物 |
5 mg |
3019 |
生物素PEG3胺 |
醛，羧酸，酮 |
胺 |
5 mg |
3024 |
生物素PEG2琥珀酰亚胺酯 |
胺 |
琥珀酰亚胺酯 |
25 mg |
3016 |
生物素PEG2马来酰亚胺* CAS 305372-39-8 * |
硫醇 |
马来酰亚胺 |
5 mg |
3015 |
生物素PEG2胺*
CAS 138529-46-1 * |
醛，羧酸，酮 |
胺 |
5 mg |
3014 |
生物素酰肼* CAS 66640-86-6 * |
醛，羧酸，酮 |
酰肼 |
5 mg |
3007 |
生物素乙二胺*
CAS 216299-38-6 * |
醛，羧酸，酮 |
乙二胺 |
5 mg |
3003 |
6. ReadiView™生物素化试剂
想要确定蛋白质的生物素化程度非常具有挑战性，因为很难从蛋白质和核酸中分辨出生物素的内在吸收。为便于确定，我们提供了一系列能进行显色反应的Boitin衍生物ReadiView™生物素。这些新型的生物素化试剂包含经过特殊设计的“颜色标签（CT）”，该标签最佳地位于两个间隔臂之间。这些间隔臂可减少空间位阻并改善水溶性，而CT标签可通过计算280 nm / 385 nm的吸收率来量化生物素化程度。CT标签不影响生物素与链霉亲和素的结合，对荧光链霉亲和素结合物的猝灭作用极小。ReadiView™生物素具有胺反应性，硫醇反应性和点击化学(Click chemistry)形式。
图3. 与专门设计的颜色标签（Color Target）结合的ReadiView™生物素琥珀酰亚胺酯（货号：3059），使其易于确定样本生物素化程度。
表6. ReadiView™生物素产品
产品名称 |
靶向官能团 |
Spacer |
规格 |
货号 |
ReadiView™生物素琥珀酰亚胺酯 |
胺类 |
聚乙二醇化 |
5毫克 |
3059 |
ReadiView™生物素马来酰亚胺 |
巯基或巯基 |
聚乙二醇化 |
5毫克 |
3058 |
ReadiView™生物素酰肼 |
醛，羧酸，酮 |
聚乙二醇化 |
5毫克 |
3055 |
ReadiView™生物素胺 |
羰 |
聚乙二醇化 |
5毫克 |
3053 |
ReadiView™生物素酸 |
胺 |
聚乙二醇化 |
5毫克 |
3050 |
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